Vol. 2° -  III.6.2.

Trascrizione del DNA

Il genoma di un organismo è costituito da sequenze di coppie di basi distribuite sui cromosomi. Tutte le coppie di basi del genoma vengono replicate durante la fase di sintesi del DNA, mentre soltanto alcune coppie di basi vengono trascritte in RNA.

Le sequenze di coppie di basi che vengono trascritte prendono il nome di geni, per cui il processo di trascrizione viene anche detto espressione genica. All’inizio e della fine di ogni gene esistono sequenze dette elementi genici regolatori, coinvolte nella regolazione dell’espressione genica.

La trascrizione genera quattro classi principali trascritti, o di molecole di RNA:

§   RNA messaggero « mRNA

§   RNA transfer « tRNA

§   RNA ribosomiale « rRNA

§   il piccolo RNA nucleare, small nuclear RNA « snRNA.

Procarioti ed eucarioti posseggono entrambi l’RNA messaggero, il tRNA e l’rRNA, mentre l’snRNA si trova solo negli eucarioti. Per il momento è importante ricordare che soltanto le molecole di mRNA vengono tradotte in proteine.

Un gene che codifica per una molecola di mRNA, e quindi per una proteina, viene detto gene strutturale. Esistono trascritti di altri geni sotto forma di RNA che rappresentano prodotti finali dell’espressione genica e che non fungono come molecole messaggere tra DNA e proteina, cioè, non vengono mai tradotti in proteine. I geni che codificano per il tRNA, l’rRNA e l’snRNA appartengono a questo tipo di geni.

I geni sono quasi sempre localizzati sui cromosomi, e rimanendo nel nucleo devono essere in grado di controllare le funzioni in tutta la cellula. Essi, attraverso la trascrizione, producono dei trascritti che possono abbandonare i cromosomi ed essere coinvolti nella sintesi proteica in altre parti della cellula.

Il DNA è una struttura stabile che si ritrova pressoché immutata al termine della riproduzione cellulare, mentre i trascritti di mRNA dovuti ai geni hanno un’esistenza limitata nel tempo, essendo degradati da enzimi cellulari, le ribonucleasi. Il mantenimento temporaneo dei trascritti di RNA è un elemento chiave nel processo di regolazione dell’espressione genica.

Fig. III. 27 - Splicing di un trascritto primario. L’RNA messaggero viene prodotto nel nucleo cellulare, sul modello di un filamento di DNA, per mezzo di un enzima denominato RNA polimerasi DNA dipendente. Sempre nel nucleo, l’mRNA primitivo così costituitosi viene sottoposto ad un rimaneggiamento, detto splicing, che consiste essenzialmente nell’eliminazione degli introni, privi di funzione codificante. L’mRNA maturo viene trasferito nel citoplasma e sistemato sui ribosomi dove viene letto.

6.2.a. Caratteristiche fondamentali della trascrizione

Nei procarioti e negli eucarioti la trascrizione avviene grazie a un processo biochimico catalizzato dalla RNA polimerasi. Prima che la trascrizione possa cominciare, la doppia elica di DNA deve essersi srotolata. Soltanto una delle due eliche di DNA viene trascritta in RNA. Questa elica è detta elica stampo, e l’elica che non funge da stampo, cioè quella complementare, ha la stessa polarità della catena di RNA.

Se tutt’e due le eliche di DNA di un gene venissero trascritte in molecole di RNA, ogni gene produrrebbe due RNA con sequenze tra loro complementari e la traduzione dei due RNA darebbe origine a due proteine molto diverse. Prove di genetica indicano invece che ogni gene strutturale codifica per una sola proteina e che accade quanto previsto, cioè che da parte di un dato gene viene trascritta una sola molecola di RNA.

Nel processo di trascrizione i precursori dell’RNA sono i ribonucleosidi trifosfati ATP, GTP, CTP e UTP, indicati come NTP (nucleosidi trifosfati L’enzima che catalizza la reazione di polimerizzazione è la RNA polimerasi, specifico per la sintesi dell’RNA, che utilizza soltanto NTP contenenti ribosio, e non quelli contenenti desossiribosio che è presente nei precursori del DNA. La polimerizzazione dell’RNA è molto simile a quella del DNA. Il nucleotide successivo da inserire nella catena è selezionato dalla RNA polimerasi per la sua capacità di appaiarsi alla base esposta sull’elica stampo di DNA. Si ricordi che le catene di RNA contengono nucleotidi con la base uracile anziché timina. Pertanto, quando si presenta sull’elica stampo del DNA un nucleotide A, verrà inserito sulla catena di RNA un nucleotide U.

6.2.b. Trascrizione del DNA

La trascrizione del DNA è attiva durante tutti i momenti dell’interfase e corrisponde alla sintesi di una molecola di RNA a partire da un solo filamento di DNA che non sia eterocromatina, in quanto il DNA dell’eterocromatina non viene trascritto perché non contiene sequenze di geni (eterocromatina costitutiva), o perché contiene sequenze di geni inattivi (eterocromatina facoltativa). Solo il DNA dell’eucromatina viene trascritto.

La trascrizione consiste nel processo di lettura delle sequenze a doppia elica del DNA in sequenze a singola elica di RNA: mRNA, tRNA, e rRNA in procarioti ed eucarioti, e nei soli eucarioti si verifica anche la sintesi di snRNA.

La trascrizione è un processo che presenta caratteristiche simili in procarioti ed eucarioti: il DNA si denatura e la RNA polimerasi catalizza la sintesi di una molecola di RNA in direzione 5’ ® 3’. Soltanto una delle due eliche di DNA viene trascritta nella molecola di RNA a singola elica. Sequenze promotrici e terminatrici stabiliscono rispettivamente dove debba cominciare e finire la trascrizione.

In Escherichia coli la sola RNA polimerasi trascrive tutte le diverse classi di RNA della cellula e cioè l’mRNA, il tRNA e l’rRNA. Nei nuclei delle cellule eucariotiche esistono tre RNA polimerasi con funzioni diverse: la RNA polimerasi I trascrive tre dei quattro rRNA, la RNA polimerasi II trascrive gli mRNA e alcuni snRNA mentre la RNA polimerasi III trascrive il quarto rRNA, i tRNA e i rimanenti snRNA.

A differenza della RNA polimerasi di Escherichia coli, nessuna delle tre polimerasi eucariotiche si lega direttamente al DNA durante la fase iniziale della sintesi dell’RNA. L’inizio della trascrizione da parte di questi enzimi è mediata da fattori trascrizionali che sono specifici per ciascuna polimerasi e che riconoscono sequenze promotrici appropriate.

Il promotore per i geni che codificano proteine è localizzato a monte rispetto al punto d’inizio della trascrizione ed è costituito da combinazioni diverse di elementi promotori. Fattori trascrizionali specifici e fattori regolatori si legano a questi elementi e facilitano l’inizio della trascrizione da parte della RNA polimerasi II. In posizione più distale rispetto al promotore si trovano delle sequenze enhancer (intensificatori), alle quali si legano dei fattori regolatori che hanno la funzione di facilitare al massimo la trascrizione genica.

I promotori dei geni trascritti dalla RNA polimerasi III sono localizzati all’interno della sequenza genica codificante e consistono in combinazioni diverse di dominî funzionali, caratteristici per la classe di RNA che viene trascritta. Questi dominî vengono riconosciuti dai fattori trascrizionali, che facilitano l’inizio della trascrizione della RNA polimerasi.

Gli rRNA 18S, 5.8S e 28S vengono trascritti in un’unica unità trascrizionale, producendo una molecola di RNA precursore. La maggior parte degli eucarioti ha le unità trascrizionali ripetute in serie, una di seguito all’altra, ripetute in tandem, separate da una sequenza spaziatrice non trascritta (nontranscribed spacer o NTS). Il promotore per l’unità trascrizionale è localizzato nell’NTS al quale si legano fattori trascrizionali specifici, che facilitano l’inizio della trascrizione dell’RNA polimerasi I.

Il materiale genetico possiede tre caratteristiche fondamentali:

ü Contiene, in forma stabile, tutte le informazioni necessarie per determinare la struttura dell’organismo, le sue funzioni, lo sviluppo e la riproduzione.

ü Si replica in modo accurato, affinché le cellule figlie possano avere la stessa informazione genetica della cellula madre.

ü È capace di variare.

Passiamo ad esaminare i processi mediante i quali il materiale genetico dirige la sintesi proteica. Poiché tutte le funzioni cellulari comportano l’azione di proteine specifiche, in ultima analisi tali funzioni vengono governate dal materiale genetico. Ogni proteina è formata da una o più catene di aminoacidi, codificati da una sequenza specifica di coppie di basi del DNA. Quando la cellula ha bisogno di una certa proteina, l’informazione genetica per la sequenza aminoacidica di tale proteina dev’essere ricavata dal DNA e quindi trasformata nel prodotto finito.

La sintesi proteica comporta due tappe:

· trascrizione: è il processo di trasferimento dell’informazione dalla molecola stampo a doppia elica di DNA a una molecola di RNA a elica singola.

· traduzione o sintesi proteica: è la trasformazione in una sequenza di aminoacidi dell’informazione codificata in seno alla sequenza di basi dell’RNA messaggero.

Mentre la duplicazione del DNA ha luogo soltanto in una fase del ciclo cellulare, negli eucarioti la trascrizione e la traduzione dei geni si verifica durante tutto il ciclo cellulare.

6.2.c. Meccanismo della trascrizione

La RNA polimerasi DNA dipendente è l’enzima che assicura la formazione di una molecola di RNA attraverso il concatenamento di nucleotidi in un ordine che è predeterminato dalla molecola di DNA. Così, per una molecola di DNA caratterizzata dalla sequenza:

CGG  ACT  TTC  GTG

la sequenza nucleotidica dell’RNA sarà ad essa complementare:

GCC  UGA  AAG  CAC

I nucleosomi non esercitano alcun ostacolo sulla trascrizione del DNA. Le RNA polimerasi riconoscono la fibra di DNA a tutti i livelli del filamento che si trova avvolto ad elica intorno ai nucleosomi. Il filamento nucleosomico soggiace ad alcune modificazioni: gli ottameri di istoni si suddividono in tetrameri, generando un filamento detto eminucleosoma e ogni eminucleosoma è circondato da un avvolgimento di DNA. La trascrizione è preceduta da un’acetilazione degli istoni e le proteine acide intervengono nella struttura funzionale del nucleofilamento per permettere l’espressione dei geni che sono programmati per ciascun tipo cellulare.

6.2.d. Tappe della trascrizione

Riconoscimento del promotore

Il promotore è una speciale sequenza di nucleotidi situata sul DNA all’inizio del gene. L’RNA polimerasi si fissa sul promotore grazie al polipeptide s (sigma). In sua assenza sembra che vi sia comunque l’inizio della lettura, ma in un punto qualsiasi del gene.

Inizio della sintesi

La sintesi di RNA inizia in un punto fisicamente diverso dal promotore: si tratta del sito d’inizio. Non appena la RNA polimerasi si lega a questo sito, il polipeptide s si allontana, e la lettura e la sintesi vengono assicurate dal nucleo centrale della polimerasi.

Copiatura del gene

La RNA polimerasi legge un filamento della molecola di DNA spostandosi nel senso 3’ ® 5’. Per giungere alla trascrizione del DNA in RNA è necessaria la selezione di precursori, che consistono in nucleosidi complementari appropriati, nonché la formazione di legami fosfodiesterici fra nucleotidi adiacenti.

I precursori, sotto forma di nucleosidi 5’ trifosfati, sono i seguenti:

q adenosina 5’ trifosfato: ATP

q citidina 5’ trifosfato: CTP

q guanosina 5’ trifosfato: GTP

q uridina 5’ trifosfato: UTP

Crescita della molecola di RNA

Via via che la molecola di RNA polimerasi si sposta lungo il filamento, i nucleotidi si uniscono fra loro con un legame fosforico 3’ Ö OH ¾ 5’ Ö OH.

Fine della sintesi

La sintesi si arresta a livello di determinati siti della molecola del DNA, che costituiscono i segnali di termine della lettura. L’arresto della sintesi avviene solo in presenza di una proteina di peso molecolare 50.000, il fattore r (rhota). Alla fine della lettura la molecola di RNA e la RNA polimerasi DNA dipendente si allontanano dal DNA. L’mRNA neosintetizzato compare nel nucleo sotto forma di fibrille pericromatiche.

La trascrizione del DNA non porta solo alla formazione di mRNA che è una copia del gene, ma anche alla sintesi di rRNA e di tRNA che sono indispensabili alla traduzione dell’mRNA, ma che non vengono tradotti in proteine.

Fatta eccezione per l’mRNA, i prodotti della trascrizione, prima di essere utilizzati, vanno incontro a modificazioni post-trascrizionali. Per esempio, l’rRNA, che si forma unicamente nel nucleolo, è una lunga molecola: rRNA 45S; subito dopo essere stato trascritto, viene metilato ad opera di metilasi e viene scisso da endonucleasi, passando alle forme 16S, 23S e 5S.

6.2.e. Regolazione della trascrizione

Le cellule regolano la sintesi di RNA in base alle loro esigenze e alle variazioni del mezzo ambiente. Per tale adattamento è necessario un controllo dell’attività dei geni, che avviene sia modificando la capacità dell’RNA polimerasi di riconoscere il sito promotore, sia agendo su un sito vicino al promotore, detto sito operatore. Tali meccanismi di regolazione sono ben conosciuti nei batteri.