Vol. 2° -  XVIII.4.2.

Vaccini aviari

Inutile indire una crociata per vaccinare i nostri polli. Gli industriali sono costretti da motivazioni economiche se non vogliono trovarsi improvvisamente sul lastrico, i fanciers debbono vaccinare per amore dei loro pupilli e per un rispetto della vita. Lo so. E la vita dei virus, chi la rispetta? Stiamo pur tranquilli, che intanto non li uccidiamo questi venefici importuni. Ci penseranno loro stessi a mutare e a darci grane a non finire. La scienza ha solo il compito di giocare a rimpiattino, dove ogni volta vince l’uno o l’altra, talora ad intervalli piuttosto brevi. Vediamo cosa offre al Pollo la metodologia del DNA ricombinante.

Fig. XVIII. 5 – The wonderful effects of the new inoculation!
Nell’incisione di James Gillary del 1802 si comincia a snobbare Edward Jenner e la vaccinazione antivaiolosa.
Erano trascorsi appena 6 anni dall’avvio di questa inestimabile conquista (1 luglio 1796).

Le numerose ricerche in merito sono state soprattutto rivolte ai seguenti obiettivi:

§ identificare i geni che codificano le proteine-antigene responsabili della risposta immunitaria

§ selezionare vettori idonei ad esprimere efficacemente tali geni

§ incorporare geni esogeni, capaci di codificare gli antigeni immunogeni, in siti o regioni del genoma del vettore non necessari alla sua replicazione.

Il virus del vaiolo aviare e l’herpes virus del tacchino e del pollo hanno mostrato di essere i vettori che meglio rispondono a questi requisiti. La loro scelta come vettori di espressione di antigeni immunoprotettivi è dovuta sia alla grandezza del loro genoma, che consente di integrare più facilmente i geni esogeni che si intende esprimere, sia al fatto che i virus del vaiolo aviare e dell’herpes del tacchino e del pollo sono innocui e già largamente noti e impiegati in campo avicolo. Inoltre, essi si moltiplicano e replicano esclusivamente nel pollo, e possono pertanto essere impiegati con sicurezza, senza rischio di trasmissione ad altre specie animali.

4.2.a. Pseudopeste aviare

I vettori finora sperimentati per esprimere gli antigeni protettivi più importanti del virus di Newcastle sono costituiti dal virus attenuato del vaiolo aviare e dall'herpes virus del tacchino e del pollo, nel cui genoma sono stati inseriti singolarmente, o in associazione, i geni F e HN del virus di Newcastle [1] . Nonostante la dimostrazione che i vaccini ricombinanti esprimenti la proteina F e quelli esprimenti la glicoproteina HN sono in grado di indurre livelli notevoli di protezione, i virus ricombinanti in grado di esprimere la proteina di fusione F hanno finora ottenuto i migliori risultati.

Una ricerca di fondamentale importanza sulle proprietà immunogene di questa proteina, espressa dall'herpes virus del tacchino, è quella compiuta da Morgan e coll., i quali hanno paragonato questo vaccino ricombinante, un vaccino vivo (HB1) e un vaccino inattivato prodotti con le tecniche convenzionali.

La risposta immunitaria indotta dal vaccino ricombinante è notevolmente ritardata rispetto agli altri due convenzionali. Infatti la protezione si instaura nel 100% degli animali soltanto 21 giorni dopo la vaccinazione. Per quanto concerne l’effetto degli anticorpi materni sulla vaccinazione, i risultati dimostrano che vi è una protezione superiore nei gruppi di pulcini vaccinati con vaccino vivo convenzionale.

Nonostante i notevoli progressi ottenuti attraverso l’impiego di vaccini vettori, essi non posseggono ancora i requisiti necessari per giustificarne l’impiego pratico. Il notevole ritardo dello stato di protezione, la scarsa capacità a stimolare l’immunità locale, la necessità di essere somministrati individualmente, costituiscono le cause più importanti che per ora limitano il loro impiego nella pratica clinica.

4.2.b. Malattia di Gumboro

La proteina strutturale VP2 costituisce il principale antigene protettivo del virus di Gumboro. Il primo vaccino ricombinante è stato ottenuto mediante espressione di questa proteina in Saccharomyces cerevisiae. L'antigene virale VP2 sintetizzato da questo lievito è stato utilizzato, dopo idonea concentrazione e purificazione, per preparare un vaccino sperimentale emulsionato in adiuvante oleoso. Questo vaccino, inoculato in polli recettivi, si è dimostrato capace di stimolare la produzione di alti livelli di anticorpi con sicuri effetti protettivi, confermando così il ruolo fondamentale della proteina VP2 nel processo di immunizzazione.

Un passo ulteriore nella produzione di vaccini di nuova generazione contro questa malattia è stato compiuto utilizzando il virus del vaiolo aviare come vettore d’espressione della proteina protettiva VP2. La sperimentazione di questo vaccino ricombinante è dovuta a Bayliss e coll., con puntura alare a 1 e a 14 giorni di vita. All’età di 28 giorni i vari gruppi di animali sono stati suddivisi in sottogruppi. Ognuno di questi è stato sottoposto al ceppo classico virulento 52/70, da cui proviene il gene protettivo VP2 integrato nel virus vettore, oppure con il ceppo altamente patogeno CS89 isolato in anni recenti da un grave focolaio di malattia di Gumboro. Mentre l’immunità prodotta dal vaccino ricombinante è in grado di proteggere il 95-100% dei pulcini dalla mortalità provocata dal virus patogeno, non è invece sufficiente ad impedire la replicazione del virus e conseguentemente la sua attività patogena a livello della borsa di Fabrizio .

Per ora il livello di protezione è significativamente più elevato nei pulcini trattati con vaccino inattivato convenzionale. La protezione risulta infatti pari al 100% nei pulcini vaccinati con una sola dose di vaccino convenzionale, mentre scende all'80% nei pulcini vaccinati con una dose di vaccino vettore, rendendosi necessarie due dosi per ottenere il 100% di protezione.

Di particolare interesse sono i recenti studi statunitensi di Vakharia e coll. Quale vettore di espressione della proteina strutturale VP2 è stato utilizzato un baculovirus coltivato su colture cellulari di insetto, Spodoptera frugiperda. Oltre al diverso tipo di virus vettore utilizzato da questi ricercatori, anche il gene inserito nel genoma di questo virus per l’espressione dell'antigene VP2 proviene, anziché dai ceppi classici impiegati nelle precedenti esperienze, da un ceppo variante di virus di Gumboro isolato negli Usa, il ceppo GLS. L'antigene VP2 del ceppo GLS espresso in baculovirus è stato estratto da cellule infette e utilizzato per allestire un vaccino sperimentale potenziato con adiuvante oleoso. Gli esperimenti confermano che l’antigene VP2 sintetizzato da un baculovirus ricombinante è altamente immunogeno, come dimostrano sia i tassi elevati di anticorpi riscontrati negli animali vaccinati sia la resistenza di questi all'infezione di prova. Dal momento che questo antigene ricombinante così ottenuto non è infettante né richiede inattivazione per la preparazione del vaccino, ed è inoltre in grado di indurre una solida risposta immunitaria, è verosimile che la metodologia elaborata da Vakharia possa costituire un’importante premessa per lo sviluppo in tempi brevi di un vaccino costituito da sub-unità virali.

Nonostante queste importanti prospettive per il prossimo futuro, nessuno dei vaccini o antigeni ricombinanti finora sperimentati ha comunque dimostrato di essere efficace come i vaccini convenzionali correntemente impiegati.

4.2.c. Malattia di Marek

I primi vaccini contro questa malattia erano costituiti da colture cellulari infettate con virus di Marek attenuato. Successivamente si è fatto ricorso a un herpes virus del tacchino antigenicamente correlato al virus di Marek. Questi due tipi di vaccino vengono universalmente utilizzati nella pratica da oltre 20 anni. Altri ceppi di virus Marek artificialmente attenuati (CVI-988) o naturalmente non patogeni (SB1, 301B) sono stati successivamente selezionati e, insieme ai vaccini tradizionali, vengono correntemente impiegati in varia combinazione.

Negli ultimi anni la biologia molecolare ha consentito di analizzare il genoma del virus di Marek e di altri herpes virus, identificando così i geni responsabili dello sviluppo dell’infezione e dell’immunità.

Recentemente, nel virus dell'herpes simplex e in numerosi altri herpes virus, sono stati identificati i geni che codificano le glicoproteine immunogene. Geni omologhi, corrispondenti a quelli dell'herpes simplex, sono stati recentemente identificati, clonati e sequenziati anche nel DNA del virus di Marek. Ciò ha consentito di sviluppare vettori virali esprimenti alcuni di questi geni, tra i quali il gene che codifica la gB e il gene della pp38, e di analizzarne il ruolo nell’induzione dell’immunità.

Le ricerche più significative sotto questo profilo sono quelle compiute da Nazerian e coll. Le prove sono state compiute in pulcini di un giorno di vita vaccinati comparativamente con un vaccino Marek convenzionale HVT e con due virus ricombinanti del vaiolo aviare esprimenti separatamente il gene della gB e quello della pp38.

Il vaccino costituito da virus ricombinante del vaiolo aviare esprimente il gene gB del virus di Marek è in grado di proteggere i polli contro la formazione di tumori e contro la mortalità causata sia dal ceppo classico omologo (GA), dal quale è stato clonato il gene gB, che da ceppi eterologhi altamente virulenti (RB1B e Md5). Al contrario, il livello di protezione indotto dal virus ricombinante esprimente la pp38 risulta di scarsa rilevanza.

Diversi sono i vaccini correntemente impiegati nella prevenzione della malattia di Marek. Singolarmente, questi vaccini non sempre sono efficaci contro tutti i ceppi di virus e frequentemente devono essere impiegati in associazione, sotto forma di vaccini bivalenti o polivalenti, soprattutto per proteggere il pollo contro i ceppi di virus cosiddetti very virulent o contro ceppi di nuova insorgenza. Inoltre, tutti i virus vaccini della malattia di Marek, ad eccezione di quelli contenenti l’herpes virus del tacchino, non sono in grado di produrre virus acellulari, e pertanto possono essere utilizzati soltanto sotto forma di vaccini associati a cellule.

Il virus vaccino ricombinante sperimentato da Nazerian ha dimostrato di proteggere sia contro i ceppi classici che contro quelli altamente virulenti, di replicarsi facilmente su colture di fibroblasti di embrione di pollo e di produrre virus acellulari ad altissima concentrazione. Ciò consente la liofilizzazione del vaccino e di conseguenza ne facilita lo stoccaggio, il trasporto e la somministrazione agli animali. Il virus del vaiolo, infine, utilizzato come vettore, è in grado di sottrarsi più facilmente agli effetti negativi degli anticorpi materni che, com'è noto, esercitano una significativa azione di interferenza sull’attività dei vaccini Marek convenzionali.

Poiché la vaccinazione dei pulcini di un giorno di vita è cruciale per un efficace controllo della malattia, l’impatto che gli anticorpi materni esercitano sull'azione del vaccino vettore di Nazerian richiede comunque ulteriori approfondimenti e verifiche. Così come sono necessarie ulteriori ricerche sulla stabilità genetica e sulla durata dell’immunità da esso prodotta. Occorre in particolare verificare se questa, come avviene per i vaccini convenzionali, sia in grado di proteggere gli animali per l’intera durata della vita economica. Se i risultati di queste prove saranno favorevoli, probabilmente in tempi brevi potremo disporre di un vaccino di nuova generazione che, per l'ampiezza dello spettro di protezione, per i costi di produzione e per la praticità di somministrazione, di stoccaggio e trasporto, costituirà un notevole progresso e miglioramento rispetto ai vaccini attuali.

4.2.d. Influenza aviare

Il grave focolaio di influenza, che nel 1983 colpì l’avicoltura in Pennsylvania, causò all'industria una perdita economica diretta di 63 milioni US$. Si calcola che i costi indiretti, dovuti alla ricostituzione degli allevamenti colpiti e alle ripercussioni sul mercato, salirono a circa 350 milioni US$.

Le variazioni degli antigeni di superficie H e N del virus dell'influenza, che possono essere di lieve (drift) e talvolta di grande rilevanza (shift), unitamente al numero cospicuo di antigeni finora identificati (13 per H e 9 per N), hanno impedito di allestire un vaccino universale, mentre ciò non accade per vaccini come quelli contro la malattia di Newcastle, la malattia di Marek e la malattia di Gumboro. Gli stessi vaccini convenzionali inattivati anti-influenza attualmente disponibili risultano efficaci solo se periodicamente aggiornati con i ceppi di virus antigenicamente diversi che frequentemente emergono nelle varie aree geografiche.

Tutte queste considerazioni, unitamente ai danni ingenti causati dall’influenza, rendono ragione dell'attenzione che i ricercatori da tempo dedicano allo sviluppo di un vaccino di nuova generazione contro questa grave forma morbosa. Poiché l’emoagglutinina (H) e la nucleoproteina (NP) del virus dell'influenza sono antigeni di fondamentale importanza per l’immunità, Webster e coll. hanno sperimentato l’attività immunoprotettiva di questi due antigeni utilizzando come vettore di espressione un ceppo attenuato di virus del vaiolo aviare. Sia il gene dell'H che della NP, espressi separatamente o in associazione nei virus ricombinanti del vaiolo aviare, derivano da un ceppo altamente patogeno del sottotipo H5N8 di virus dell'influenza.

È interessante rilevare come tutti i pulcini immunizzati con i vaccini ricombinanti abbiano manifestato le tipiche reazioni da vaccinazione anti-vaiolo nel punto d’inoculazione, confermando la stabilità dell'attività replicativa del virus vettore. Alla prova di infezione, tutti i polli vaccinati con vaccino vettore esprimente la H da sola o in associazione alla NP, sono risultati protetti dopo il contatto con il ceppo di virus omologo. Infatti i soggetti non hanno manifestato né sintomi di malattia né mortalità, e i test di reisolamento del virus challenge [2] dalla trachea e dalla cloaca sono risultati negativi, a testimonianza dell'alto livello di protezione sistemica e locale indotta dal vaccino.

I gruppi di pulcini infettati con il ceppo variante di virus sono risultati invece protetti contro i sintomi clinici ma non contro l’infezione, come dimostrano i risultati positivi di reisolamento del virus challenge sia a livello della trachea che della cloaca. I pulcini vaccinati con vaccino vettore contenente soltanto il gene NP hanno invece presentato sintomi gravi di malattia, con alta incidenza di mortalità. La co-espressione della H e della NP in un medesimo virus vettore non ha dimostrato di migliorare l’attività immunoprotettiva della sola H ricombinante.

I risultati delle sperimentazioni di Webster e coll. dimostrano pertanto che la H espressa dal virus del vaiolo ha un potere immunizzante di notevole efficacia contro l’influenza, soprattutto nei confronti dei ceppi di virus appartenenti al medesimo sottotipo dell'H espressa. Sono comunque necessarie ulteriori ricerche e conferme di campo dei risultati di laboratorio prima di esprimere una definitiva valutazione sulla possibilità di introdurre questo vaccino nella pratica, sia in sostituzione che in combinazione con i vaccini inattivati attualmente disponibili sul mercato.

4.2.e. Bronchite infettiva

Il virus della bronchite infettiva è un coronavirus, che nel pollo provoca una malattia acuta respiratoria altamente contagiosa. In Italia, come in numerosi altri Paesi europei ed extraeuropei, l’infezione da bronchite infettiva è spesso associata a una grave forma di nefrosi.

Le perdite sono causate dalla mortalità e dalle complicanze respiratorie che si instaurano frequentemente nei broilers, nonché dal calo di produzione delle uova e scadimento della loro qualità allorché l’infezione colpisca le galline in periodo depositivo.

Per il controllo della malattia vengono attualmente impiegati vaccini vivi attenuati e vaccini inattivati. Le correlazioni di protezione crociata tra i diversi virus della bronchite costituiscono un notevole ostacolo alla selezione e all’impiego di ceppi idonei per la vaccinazione. Le esperienze di campo inducono a ritenere che gli insuccessi dei vaccini sono causati dall’insorgenza o dalla selezione di varianti e sierotipi di virus diversi da quelli contenuti nel vaccino.

Da ciò scaturisce la necessità di allestire vaccini dotati di ampio spettro protettivo, capaci di immunizzare contro le numerose varianti antigeniche. Quest’obiettivo ha indotto diversi ricercatori ad applicare la biotecnologia anche nella produzione dei vaccini contro questa grave forma morbosa. Tuttavia, sia a causa delle frequenti variazioni antigeniche di questo virus, sia per gli insuccessi ottenuti con i virus ricombinanti finora sperimentati, le prospettive di vaccini di nuova generazione efficaci contro la bronchite infettiva appaiono, allo stato attuale delle conoscenze, abbastanza remote.